石迎迎， 潘 芬， 杜青青， 王 春， 蒋 婕， 于方圆， 余绍兵， 孙 燕， 秦惠宏， 张 泓

作者单位：上海交通大学附属儿童医院检验科，上海 200040。

金黄色葡萄球菌（金葡菌）是引起医院感染和社区感染常见的病原菌之一，其感染可导致多种类型的疾病，包括皮肤和皮肤结构感染、败血症、心内膜炎及肺炎等[1]。金葡菌引起儿童感染的发病率逐年升高，自1996—2006 年，美国每十万名儿童中，每年约有69.9 人次因皮肤和皮肤结构感染入院，其中耐甲氧西林金葡菌（MRSA）感染占9.6%，且其住院率显著上升[2]。全国细菌耐药监测网（CARSS）报道金葡菌位列脓液标本分离菌的首位。近年来，我国儿童患者金葡菌的总体检出率呈逐年上升趋势，因此，加强儿童人群金葡菌分子流行学研究显得尤为重要。本组资料以上海市儿童医院2020 年90 例金葡菌（经脓液样本中分离）皮肤软组织感染患儿为研究对象，对病例临床特征资料进行收集整理，并对菌株耐药性、毒力基因、分子分型进行检测，以分析皮肤软组织感染患儿金葡菌的临床特征、耐药情况、毒力基因携带率以及克隆分布及变化趋势，并比较MRSA 组和甲氧西林敏感金葡菌（MSSA）组分离株间的分子特征差异。

1.1 菌株来源、鉴定及药敏

收集2020 年我院90 例皮肤软组织感染患儿临床信息，以及从患儿脓液标本中初次分离到的金葡菌，共90 株。使用自动化MALDI-TOF 质谱仪（Bruker，德国）鉴定菌株到种，采用肉汤微量稀释法进行药物敏感性试验，替加环素药敏结果判读参考美国食品和药品监督管理局（FDA）标准，其余结果判断采用美国临床和实验室标准化协会（CLSI）2020 年标准[3]。以金葡菌ATCC 25923 和ATCC 29213 为质控菌株。

1.2 DNA 提取及MRSA 的检测和确认

采用离心柱型细菌基因组DNA 提取试剂盒（北京天根生化科技公司）提取细菌DNA，严格按试剂盒说明书进行操作；
经药敏结果初步筛选，再通过PCR 方法扩增mecA基因[4]， PCR 扩增阳性的菌株确认为MRSA，阴性菌株确认为MSSA。本研究所用引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 毒力基因检测

采用PCR 方法检测菌株的15 种毒力基因[5-8]，包括6 种肠毒素基因（sea、seb、sec、sed、seg及sei）、4 种黏附毒素基因（icaA、sdrD、sdrE及clfA）、2 种溶血素基因（hla及hlb）、杀白细胞毒素基因pvl、中毒性休克综合征毒素基因tst、表皮剥脱毒素基因eta。

1.4 金葡菌的分子分型

1.4.1 多位点序列分型（MLST） 根据参考文献合成7 个管家基因（arcC、aroE、glKF、gmk、pta、tpi、yqiL）的引物序列[9]， 分别对菌株DNA进行PCR 扩增后，将所得产物送上海生工公司测序，测序结果提交至MLST 网站（https://pubmlst.org/organisms/staphylococcus-aureus）得到序列型（ST）。使用PHYLOViZ 2.0 软件对ST 型进行聚类分析定义克隆复合群（CC）。

1.4.2 葡萄球菌A 蛋白序列分析 对金葡菌spa基因多态X 区进行PCR 扩增[10]并测序，序列提交至金葡菌A 蛋白序列（SPA）分型数据库（https://spa.ridom.de/）比对确定SPA 分型。

1.4.3 葡萄球菌盒式染色体（SCCmec）分型 采用多重PCR 方法对MRSA 分离株的SCCmec进行Ⅰ～Ⅴ的分类[11-13]，扩增产物送测序并通过BLAST 网站比对序列加以确认。引物序列见表1。

表1 金黄色葡萄球菌SCCmec 分型基因引物序列Table 1 Sequences of the primers for SCCmec genotyping of Staphylococcus aureus

1.5 统计方法

本研究采用软件IBM SPSS 21.0 进行统计学分析。对计数资料根据适用条件使用卡方（χ2）检验。对于计量资料分析采用独立样本t检验。对于不符合正态分布的数据，采用非参数检验分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2.1 菌株分布

对90 例分离金葡菌的皮肤软组织感染患儿病例资料进行分析整理， 男51 例（56.7%），女39 例（43.3%）。年龄分布情况，小于28 d 的新生儿19例（21.1%），28 d～＜3 岁的婴幼儿39 例（43.3%），3～＜6 岁学龄前儿童7 例（7.8%），≥6 岁的学龄期儿童25 例（27.8%）。分离的金葡菌中MRSA 44 株，主要包括脐部皮肤软组织感染分离17 株（38.6%），其次是手部皮肤软组织感染分离6 株（13.6%）。MSSA 46 株，其中颈部皮肤软组织感染分离9 株（19.6%），其次是手部和耳前瘘管分离各6 株（13.6%）。见表2。

表2 金黄色葡萄球菌所致儿童皮肤软组织感染90 例的相关临床信息Table 2 Clinical details of skin and soft tissue infections caused by Staphylococcus aureus in 90 children

表2（续）Table 2（continued）

2.2 菌株耐药率

90 株金葡菌中MRSA 对青霉素的耐药率为100%。未发现对利福平、利奈唑胺、万古霉素、米诺环素及替加环素耐药菌株。见表3。

表3 皮肤软组织感染患儿分离的90 株金黄色葡萄球菌对抗菌药物的敏感性Table 3 Antimicrobial susceptibility of 90 strains of Staphylococcus aureus isolated from skin and soft tissue infections in children

2.3 葡萄球菌相关毒力基因

在肠毒素基因sea、seb、sec、sed、seg和sei6 个基因中以sei肠毒素基因的检出率最高，为66.7%（60/90）。

icaA、sdrD、sdrE和clfA等4 个黏附毒素基因均有较高的检出率。sdrD的检出率为66.7%（60/90），sdrE为92.2%（83/90），icaA和clfA检出率均为100%。大多菌株为多种黏附毒素基因携带株，如同时携带有icaA-clfA-sdrD-sdrE4 种基因的菌株达61.1%（55/90）。

溶血素基因中hla检出率高，达100%；
hlb的检出率较hla低，为32.2%（29/90）。杀白细胞毒素基因pvl有较高检出率，为58.9%（53/90）。中毒性休克综合征毒素基因tst检出率低，仅15.6%（14/90）。表皮剥脱毒素基因eta检出率更低，仅2.2%（2/90）。

各组毒素基因在MRSA 和MSSA 中的检出结果见表4，其中MSSA 组和MRSA 株均检出杀白细胞毒素基因pvl，且pvl检出率MSSA 高于MRSA；
此外黏附毒素基因联合携带率以及溶血毒素基因联合携带率在MSSA 组亦均显著高于MRSA组，但MRSA 组的seb肠毒素基因检出率显著高于MSSA 组；
肠毒素基因sec-seg-sei和sec-seg联合携带情况，MRSA 组亦均显著高于MSSA 组。

表4 MRSA 组与MSSA 组毒素基因携带率分析Table 4 Analysis of virulence gene carrying rate in MRSA group and MSSA group

2.4 金葡菌MLST、SPA 和SCCmec 分子分型

2.4.1 金葡菌MLST 90 株儿童皮肤软组织感染金葡菌主要的MLST 分型为ST22（46.7 %，42/90）、ST59（18.9 %，17/90）、以及其他各种ST1、ST15 等型共16 个型。

2.4.2 SPA 分型 90 株儿童皮肤软组织感染金葡菌SPA 分 型 主 要 为t309（20.0 %， 18/90）、t437（16.7 %，15/90）、以及其他各种t005、t015 等共36 型。

2.4.3 金葡菌SCCmec分型 主要涉及44 株MRSA，主要为Ⅳ型和Ⅴ型，各占31.8%（14/44）和61.4%（27/44）,其他有2 株Ⅰ型和1 株Ⅲ型。见表5。

表5 儿童皮肤软组织感染MRSA 的分子分型Table 5 Molecular typing of MRSA isolated from skin and soft tissue infections in children

综 合MLST、SPA 和SCCmec分 型 在 儿 童皮肤软组织感染MRSA 组中，最常见的流行株为ST22-t437 型， 占18.2%（8/44）；
ST22-t437-SCCmecⅤ、ST22-t309-SCCmecⅤ均占9.1%，是MRSA 分离株最常见的克隆型；
ST22-t437 型仅存在于MRSA 组。MSSA 组中最常见的流行株为ST22-t309 型和ST59-t309 型，均占15.2%（7/46）。ST59-t309 型仅存在于MSSA 组，ST22-t309（11/90）型是儿童皮肤软组织感染中最常见的流行株。

儿童是皮肤和皮肤结构感染患者中的主要群体之一，且复发率超过50%[14]。本组资料分离的90 株金葡菌中MRSA 株为44 株，MSSA 株为46 株。如同既往报道，本组的MRSA 对抗菌药物的耐药率显著高于MSSA 菌株。故当金葡菌引起感染时需要尽快明确是MRSA 还是MSSA，为临床用药提供依据。本组资料MRSA 分离部位占比最高的为脐部皮肤软组织，虽然按照MRSA 治疗原则，不宜使用β 内酰胺类抗生素。但本研究对象均为儿童，且以新生儿脐部皮肤及皮肤结构感染为主，在无基础疾病的前提下可以使用β 内酰胺类抗生素联合外科清创换药，临床治疗效果以及结局良好，仅在合并基础疾病时考虑直接使用万古霉素或利奈唑胺等糖肽类抗生素。此种治疗与何礼贤[15]阐述的社区获得性MRSA 所致皮肤软组织感染轻者仅需外科处理，而不需要系统性药物治疗相一致。

本组资料6 类毒素基因的检出率大多与文献报道的相一致。如MRSA 组与MSSA 组中肠毒素基因以sei基因检出率最高（59.1%和73.9%），与刘金月[16]发现的骨髓炎患者MSSA 组sei基因检出率最高（46.67%）相一致。两组中黏附毒素基因的检出率≥50%，且大多是两种或以上的毒素基因同时存在，如ica-clfA基因的检出率为100%，此研究结果与Park 等[17]研究结果一致；
提示金葡菌菌株的黏附能力均较强，推测可能是造成皮肤软组织感染反复，细菌难以清除等的主要因素。MRSA 组与MSSA 组中溶血素基因hla基因的检出率均为100%，提示其在金葡菌中具有高携带率，此研究结果与储丹丹[18]研究结果相近。MRSA 组与MSSA 组两种溶血素基因hla-hlb的同时携带率分别为52.27%与13.04%，MRSA 组携带率显著高于MSSA 组（P＜0.05），提示溶血素毒素在儿童皮肤软组织感染MRSA 中具有重要的致病作用。表皮剥脱毒素基因eta在MSSA 组中未检出，在MRSA 组检出率也普遍较低，仅为4.5%，与Koosha 等[19]研究结果较一致，分离自皮肤创口创面分泌物的金葡菌eta基因携带率仅为7.6%。提示皮肤软组织感染及伤口分泌物中金葡菌的eta基因处于低携带率。MRSA 组与MSSA组中icaA基因的检出率均为100%，sdrE基因在两组间的检出率较高（95.5%和89.1%）；
seg基因检出率与Kim 等[20]报道的关节假体金葡菌seg基因检出率不一致，提示皮肤浅表与深层分离到金葡菌的毒力基因携带情况不同。sea基因在两组中的检出率分别为23.3%和17.6%，此研究结果显著低于罗寒梅等[21]关于成年人痰液标本MRSA组63.33%的检出率。MSSA 组未检测到seb基因，MRSA 组seb基因检出率为20.5%，然而此检出率却明显低于储丹丹[18]报道的云南省某三甲医院MRSA 组菌株seb基因的检出率（76.92%）。本组资料中sea基因与seb基因的携带情况均低于以上两位学者的报道，推测与研究人群、标本来源部位以及地域不同相关。MRSA 组与MSSA 组中杀白细胞毒素基因pvl的检出率均较高，分别为50.0%和67.4%。此研究结论高于储丹丹[18]关于云南省的调研结果（33.85%），与海南Li 等[22]的研究结果较一致（47.6%），提示MRSA 菌株pvl基因携带率具有显著的地域性差异。

本资料MRSA 组共检出了15 个葡萄球菌A蛋白SPA 型别的序列，其中主要型别t437 占比为34.1%，此结果与大多数学者的研究结果一致[23-24]。MRSA 组的次要型别为t309 及t005，其占比分别为18.2%及9.1%，储丹丹[18]探究云南省MRSA菌株的SPA 分型情况，研究结果显示其次要型别为t030 及t034，占比分别为21.54%及7.69%，张杰[23]探究江西地区皮肤及皮肤结构感染患者MRSA 菌株的SPA 分型情况，结果显示其次要型别为t114，占比为10%，提示MRSA 菌株SPA 分型的次要型别存在明显的地域性差异和/或标本差异。

文献报道ST22 型菌株具有极强的传播能力和较大的毒性。Baldan 等[25]研究发现ST22-Ⅳ在体外能有效侵入细胞，体内致病性显著性升高。同时pvl阳性曾被认为是社区感染MRSA 检出的重要特征[26]。但在多年前pvl阳性菌株国内检出率极低[27]。本组资料显示引起90 例皮肤和皮肤结构感染最为常见的金葡菌菌株为ST22 型，此与Xiao 等[28]2019 年报道的北京地区皮肤与皮肤结构感染患者的金葡菌MLST 结果为ST22 型相同。90 株金葡菌中MLST ST22 型菌株共有42 株（46.7%42/90），MRSA 和MSSA 各 半， 均 为21 株。ST398 型仅有4 株，且均为MRSA 菌株。综合SPA 分型及pvl检测，本组资料显示ST22-t309 菌株（12.2%，11/90）为本次皮肤软组织感染患儿最常见的流行株。在21 株ST22 型的MSSA 中竟无一株t437 株，但有7 株ST22-t309（15.2%）和7 株为ST59-t309（15.2%）。无论是44 株MRSA或46 株MSSA 中均检出多株pvl阳性株，检出率分别是50%和67.4%。这与Xiao 等[28]2019 年报道的研究结果pvl50%的阳性检出率大致相仿。本组资料显示pvl阳性MRSA 主要为ST22-t437、ST15-t437、ST7-t437 和ST22-t309；
在MSSA 中pvl阳性主要型别为ST22-t309 及ST59-t309。PVL是金葡菌的关键毒力因子，主要与皮肤或黏膜坏死病变相关。

因此，本组资料可以为临床医师治疗儿童皮肤和皮肤结构感染提供基础性数据，警惕可能因ST22 型等菌株流行导致的暴发性感染，提前做好预防措施。已经有研究报道1 种新型的杀白细胞毒素基因pvl阳性ST22 型MRSA 菌株在日本引起了长期的家族型感染[29]。因此，这种菌株的出现切不可掉以轻心，需引起重视。

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