郭新月, 张 岚,2, 张 晴, 左春柳, 李松洋, 严新悦, 袁 敏,2

(1.华北理工大学 生命科学学院,河北 唐山 063210；

2.华北理工大学 基因组学与计算生物学研究中心,河北 唐山 063210)

油菜素甾醇(BRs)作为一种植物内源类固醇激素,自从20世纪70年代被科学家们发现以来,其极强的生理活性激发了国际生物学和化学等领域科学家们浓厚的研究兴趣.从BRs的生物合成与代谢、信号转导、到生理作用,科学家们对BRs生物学功能的认识越来越深入.

不同于动物甾醇类激素只在特定的组织器官合成,植物体内几乎所有的组织都具有甾醇类激素的合成能力.BRs合成的关键基因突变可导致植株矮化,叶片颜色深绿,叶柄缩短,花期延迟和顶端优势减弱等表型,外源施加BRs能恢复BR合成突变体的表型[1-2].植物体内产生的BRs首先被细胞膜表面的受体BRI1识别,BRs的结合磷酸化并激活BRI1及其共受体BAK1[3-4].活化的BRI1磷酸化并激活下游的激酶BSKs和CDG1,后者进一步磷酸化并激活下游的磷酸酶BSU1[5-6].活化的BSU1去磷酸化并失活下游的激酶BIN2[7].与此同时,磷酸酶PP2A快速地去磷酸化并激活转录因子BZR1/BES1[8],去磷酸化后的BZR1/BES1进入细胞核调节下游基因的表达[9-10],将信号向下传导,参与调控植物体内多种生理过程的调控,包括促进细胞伸长与生长、暗形态建成、器官边界形成,气孔发育,性别决定,维管组织分化,雄性繁殖,种子萌发,开花,衰老,以及对各种非生物和生物胁迫的抗性等[11-13].

目前油菜素甾醇类物质已发现70多种,并实现了大规模低成本工业化生产.农业生产上,BRs对水稻、小麦、玉米、棉花、芹菜、番茄、草莓和葡萄等多种植物表现出增产增收、提高抗逆性或提高果实品质等效果[14-15].随着研究的深入,人们发现BRs影响植物生长和发育与浓度相关,尤其表现在BRs对植物根系的影响,并且不同植物根系对BRs的响应浓度存在差异[16].通常较低浓度的BRs促进植物主根和侧根的发育,较高浓度的BRs促进侧根发育的同时抑制主根的生长,过高浓度的BRs显著抑制生长,主根和侧根发育均受到显著抑制[17].但是低浓度BRs促进而高浓度BRs抑制根生长的发育机制目前还不清楚.本研究利用转录组技术分析了不同浓度BRs处理下番茄幼苗根部的基因表达变化,旨在解析BRs调控植物根系发育的信号转导途径,为更加有效地利用BRs激素奠定基础.

1.1 试验材料

供试番茄品种为Micro-Tom,来源于华北理工大学生命科学学院植物分子生物学实验室.

1.2 番茄幼苗不同浓度BRs处理及表型观察

番茄种子用70 %酒精消毒1 min,10 %次氯酸钠消毒7 min,无菌水冲洗6～8次后置于浸湿的灭菌滤纸上,28 ℃催芽48 h后分别点种于含有0,0.5,1,10和50 nmol/L 表油菜素内脂(eBL，BRs的一种)的1/2 MS固体平板培养基上,25 ℃，16 h光照/8 h黑暗条件下竖直培养4 d后观察并拍照.Image J软件测量各组根长,并利用Student′s t-test进行差异分析.

1.3 转录组测序分析

1.3.1 样品收集、RNA提取及测序

将番茄幼苗在0,0.5,10 nmol/L eBL的1/2 MS固体培养基上竖直培养4 d,取根部,液氮冻存后送至上海元莘生物科技有限公司进行转录组测序,每组设置三个生物学重复.经RNA提取、质控、文库构建、文库质检步骤后上机进行双端测序.测序原始数据已上传至Genome Sequence Archive(GSA,组学原始数据归档库),收录编号为CRA006812.

1.3.2 生物信息学分析

将测序原始数据(raw data)进行质量过滤获得高质量的质控数据(clean data)并汇总统计.利用HISAT2的算法将质控数据于小番茄ITAG4.0参考基因组进行比对,(https:∥data.jgi.doe.gov/search?q=ITAG4.0&expanded=Phytozome-691),并用Stringtie拼接鉴定新基因和新转录本.针对已知和新鉴定的基因和转录本,经过质量控质后与NR(非冗余蛋白数据库,https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)，SwissProt(蛋白质序列数据库,https:∥www.uniprot.org/)，PFAM(蛋白质家族数据库,https:∥pfam.xfam.org/)，GO(基因本体数据库,http:∥geneontology.org/)，KEGG(代谢通路数据库,https:∥www.kegg.jp/kegg/pathway.html)及STRING(蛋白网络互作数据库,https:∥cn.string-db.org/)六大数据库进行比对注释,全面获取基因和转录本的功能信息.通过比对计算基因的表达水平.根据Hisat2软件的比对结果,计算每个基因/转录本在样本中的FPKM(每千个碱基的转录每百万映射读取的基因片段值)值,作为基因/转录本在样本中的表达量,进而对表达数据进行统计学分析,依据|log2FoldChange|>=1.00为标准筛选不同样本之间显著差异表达的基因.针对差异表达基因进行GO与KEGG功能注释与富集分析.利用GO数据库可以将基因按照参与的生物学过程、构成细胞的组分、实现的分子功能分类.利用KEGG数据库可以将基因按照参与的信号通路或行使的功能分类.

表1 引物列表Tab.1 List of Primers

1.4 实时荧光定量PCR( qRT-PCR)检测候选基因的表达量

将番茄幼苗在0,0.5,和10 nmol/L eBL的1/2 MS固体培养基上竖直培养4 d,提取根部总RNA,反转录获得cDNA.设计候选基因和内参基因(actin)特异性引物,见表1.qRT-PCR程序为：预变性(95 ℃,15 min),变性(95 ℃,10 s),退火延伸(60 ℃,32 s),40个循环.每个样品设置3次重复.利用单因素方差分析进行表达量的差异显著性检验.

2.1 高浓度BRs抑制番茄幼苗主根伸长

为了研究BRs对番茄根系发育的影响,本研究比较了不同浓度eBL(0.5,1,10，50 nmol/L)处理4 d的番茄幼苗根系的形态特征.与对照相比,当eBL浓度为0.5 nmol/L时,主根长度增加,但差异不显著；
当eBL浓度升高至1 nmol/L时,主根长度变短,但差异不显著；
当eBL浓度升高至10 nmol/L及更高浓度时,主根伸长被显著抑制(图1).

图1 番茄幼苗主根对不同浓度eBL的响应Fig.1 The Response of Tomato Seedlings Upon Different Concentration of eBL Treatment

表2 六大数据库注释结果Tab.2 Annotation Result in Six Different Databases

2.2 基因组比对与注释

为了解析高浓度BRs抑制番茄幼苗主根伸长的分子机理,本研究对0，0.5，10 nmol/L的eBL培养基上竖直培养4 d的番茄幼苗根组织进行了转录组测序.测序共获得 60.305 Gb质控后测序数据,单个样品测序数据量均在6.87 Gb以上,各样品平均数据量为 6.701 Gb,Q30(碱基错误识别率为0.1 %称为Q30)碱基百分比在 93.06 %以上,GC含量为 42.42 %～42.60 %.将各样品的质控后测序数据与指定的参考基因组进行序列比对,比对率从94.887 %到95.336 %不等,其中唯一比对率为92.530 %～92.950 %.六大数据库注释结果如表2所示,NR数据库注释率最高,共获得30 463个基因注释.

2.3 差异基因的鉴定

为了分析比较eBL处理组与对照组基因表达的差异,本研究对34 075个基因进行了表达量分析,基于基因表达量定量结果,进行组间差异分析,获得组间差异表达的基因.0.5 nmol/L eBL处理组与对照相比,差异基因数较少,只有56个,包括46个上调和10个下调基因.这一结果与0.5 nmol/L eBL促进主根伸长不明显相吻合.10 nmol/L eBL处理组与对照相比,主根伸长被显著抑制,测序获得的差异基因数也较多,共585个,包括271个上调和314个下调基因(表3).

表3 不同浓度eBL处理获得的差异表达基因统计Tab.3 Summary of the Number of DEGs Detected Under Different Concentration of eBL Treatment

2.4 差异基因GO富集分析

为了进一步获得差异表达基因的功能信息,本研究分别对上调和下调基因进行了GO富集分析,将基因按照参与的生物学过程、构成细胞的组分,实现的分子功能等进行分类,同时对GO富集最显著性的前10位GO条目绘制网络图.0.5 nmol/L eBL处理与对照相比获得的差异基因数目太少,未得到GO富集结果.10 nmol/L eBL处理产生的差异表达基因GO富集分析表明,上调基因主要富集在乙烯合成(ethylene biosynthetic process)和代谢(ethylene metabolic process),烯烃合成(alkene biosynthetic process,olefin biosynthetic process)和代谢(cellular alkene metabolic process,olefin metabolic process)2个方面.

橙黄节点代表GO条目；
其他颜色的节点代表是富集到每个GO条目中的差异基因；
橙黄节点的大小与富集到该通路中的差异基因个数成正比.图2 10 nmol/L eBL处理上调基因的GO富集网络图Fig.2 GO Enrichment Network Diagram of Up-regulated Genes Under 10 nmol/L eBL Treatment

2.4 差异基因KEGG富集分析

KEGG数据库提供了整合代谢途径查询,系统分析基因功能和基因组信息,有助于把基因及表达信息作为一个整体网络进行研究.为了获得10 nmol/L eBL处理的差异基因参与的信号通路信息,本研究分别对上调和下调基因进行了KEGG富集分析,同时对KEGG富集最显著性的前10位KEGG条目绘制网络图.结果如图3和表4所示,上调基因在乙烯合成通路(cysteine and methionine metabolism),植物激素信号转导(plant hormone signal transduction),植物MAPK信号转导(MAPK signaling pathway-plant)和次级代谢产物的合成与代谢(biosynthesis of secondary metabolites)这几方面有明显的富集.

橙黄节点代表KEGG条目;其他颜色的节点代表是富集到每个KEGG条目中的差异基因;橙黄节点的大小与富集到该通路中的差异基因个数成正比.图3 10 nmol/L eBL处理上调表达基因KEGG富集网络图Fig.3 KEGG Enrichment Network Diagram of Up-regulated Genes Under 10 nmol/L eBL Treatment

表4 10 nmol/L eBL处理上调表达基因KEGG富集结果列表Tab.4 KEGG Enrichment List of Up-regulated Genes Under 10 nmol/L eBL Treatment

2.5 乙烯合成相关差异表达基因的qRT-PCR验证

转录组测序结果显示eBL处理后番茄幼苗根中乙烯合成关键基因ACO(ACC氧化酶)和ACS(ACC合成酶)出现了明显的表达上调.为了进一步证实该结果的准确性,本研究利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术验证了0.5，10 nmol/L eBL处理后番茄幼苗根中ACO和ACS的表达量.结果显示,与对照相比,0.5，10 nmol/L eBL处理均显著促进了ACO和ACS的表达,且10 nmol/L eBL处理产生的促进效果更明显(图4).

误差线代表3次生物学重复间的标准误差; a,b,c代表显著性差异p<0.05.图4 qRT-PCR检测含有不同浓度eBL的1/2 MS培养基上生长4 d的番茄幼苗根中ACO和ACS的表达量Fig.4 qRT-PCR Analysis of ACO and ACS Expression in the Tomato Roots of 4-day-old Seedlings Grown in 1/2 MS Medium Containing Different Concentrations of eBL

根系在植物的整个生命周期中发挥非常重要的作用,除了固着支持植株地上部分,还负责从土壤中吸收供植株生长发育所需的水分、无机盐和矿物质等营养元素,合成并贮存有机物质.根深才叶茂,根系与地上部在代谢上紧密相联,因此,对根系及其生长发育调控机理的研究,有助于农业上提高作物抗逆性，保证作物产量和品质.

根发育过程主要包括胚发育、分生区细胞的分裂和分化、伸长区细胞的伸长、成熟区根毛的形成与侧根的起始和形成等.这一系列生长发育过程受到自身发育年龄,环境和激素等多种因素的影响,而根系的发育具有很大的可塑性,奠定了植物适应外界复杂多变环境的基础[16-17].已有研究表明生长素在植物根生长发育中发挥重要作用,外源施加生长素抑制主根的伸长而促进侧根的产生.进一步研究发现生长素在分生区静止中心区域积累,诱导PLT(plethora)基因的表达.外源施加乙烯合成前体ACC抑制主根伸长,并激活了AUX1和PIN2的表达.铬通过激活生长素转运蛋白基因AUX1导致生长素在根尖积累,进而抑制主根伸长,并且乙烯在此过程中起到协同作用[18-20].以上均表明生长素和乙烯交互调节根的发育.BRs被认为是一种新型的植物生长促进类激素,源于20世纪70年代Michell等发现它能够使豌豆幼苗节间伸长.越来越多的证据表明BRs最典型的就是作用于细胞的伸长和分裂,并且在根细胞伸长、侧根起始以及大豆根瘤发育中发挥重要作用[21-22].Chaiwanon等[17]发现低浓度的BRs促进拟南芥根的伸长,而高浓度的BRs会抑制拟南芥根的伸长.不同浓度BRs处理小麦幼苗,主根和侧根均表现出低促高抑的现象,BRs浓度越高,抑制越严重.但是目前存在很多悬而未决的问题,如低浓度BRs促进而高浓度BRs抑制根生长的发育机制是什么；
植物如何感知不同的BRs浓度；
根中是否存在不同亲和力的BRs受体.

BRs调控植物生长发育和代谢往往是与其他信号通路中的组分交互作用.已有研究表明BRs促进乙烯的生物合成而诱导气孔关闭[23].BRs信号转导通路的转录因子BZR1和乙烯信号通路的转录因子EIN3相互作用,协同调控基因表达,在暗中促进顶端弯钩的发育,在光下协同促进细胞伸长,进一步丰富和完善了植物激素BRs和乙烯交叉互作的分子调控网络[24-25].本研究中不同浓度BRs处理番茄幼苗,同样发现高浓度BRs显著抑制了番茄幼苗主根伸长.转录组分析表明,高浓度BRs处理引起乙烯合成通路,植物激素信号转导,植物MAPK信号转导和次级代谢产物的合成与代谢等途径的基因明显上调,进一步荧光定量PCR检测证实0.5，10 nmol/L eBL处理均显著促进了乙烯合成相关基因ACO和ACS的表达.结果暗示BRs和乙烯可能交叉互作调控高浓度BRs对植物主根生长的抑制,但是,二者交互影响的下游组分仍需进一步研究.

番茄营养丰富,既是蔬菜也是水果,是人们日常生活中不可或缺的果蔬之一,在中国南北方均广泛种植.高产优质番茄的培育对我国农业生产具有十分重要的意义.目前,番茄中有关BRs方面的研究还较少,限制了这一重要激素在番茄生产种植中的应用,本研究分析了不同浓度BRs处理对番茄幼苗根系的影响,研究结果不仅可为BRs在番茄生产中的科学正确使用提供理论基础,也对BRs在植物根系发育的作用机制研究提供了支撑.

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