杨元英

(广西大学，南宁 530004)

牡蛎含有丰富的蛋白质和微量元素，具有降血压、抑菌、抗氧化等作用，以牡蛎为原材料进行深加工，制取生物活性肽成为当前牡蛎深加工的重要方式[1-2]。牡蛎多肽一般采用酶水解的方式，过程中影响因素较多，因此对牡蛎多肽提取工艺进行优化分析成为提高多肽提取率的重要措施[3-4]。本文通过酶水解的方式，对牡蛎多肽提取率影响因素进行综合分析，确定最佳提取工艺条件，并对牡蛎多肽的抗氧化活性进行研究，为牡蛎的深加工提供借鉴。

将新鲜牡蛎肉沥干处理后称取200 g，加入5 000 mL蒸馏水，使用匀浆机对其进行搅拌处理，放置于50 ℃条件下进行振荡摇匀，混合均匀后在90 ℃条件下进行水浴，水浴时间10 min，水浴完成后在5 000 r/min条件下进行离心处理，离心时间10 min，离心完成后收集上清液[5]。将收集好的牡蛎上清液进行超滤处理，使用1 000 Da的超滤膜进行过滤，收集牡蛎上清液过滤液，此时收集到的牡蛎多肽过滤液分子量小于1 000 Da；
将超滤膜更换为360 Da，对收集到的过滤液再次进行过滤，此时收集到的牡蛎多肽过滤液分子量大于360 Da，小于1 000 Da。收集两次过滤后的滤渣，放置于500 mL圆底蒸发瓶中，在40 ℃条件下进行干燥处理，获取牡蛎淡黄色多肽粉末[6]。

为了测定牡蛎多肽提取过程中加酶量对多肽酶水解度的影响，设定牡蛎肉混合溶液料液比为1∶3，设定酶解反应时间为5 h，酶解反应温度为50 ℃，酶解反应溶液pH值为7.5，酶的添加量分别设定为1%、2%、3%、4%、5%，酶解完成后测定牡蛎多肽酶水解度[7]。加酶量对牡蛎多肽酶水解度的影响见表1。

表1 加酶量对牡蛎多肽酶水解度的影响Table 1 Effect of enzyme addition amount on enzymatic hydrolysis degree of oyster polypeptides %

由表1可知，当牡蛎肉混合溶液料液比一定时，随着加酶量的升高，酶与牡蛎多肽分子的接触机会增加，同一时间内的牡蛎多肽分子水解数量增加，因此牡蛎多肽酶水解度不断升高，当加酶量高于3%时，牡蛎多肽酶水解度未发生明显变化，主要原因是随着加酶量的升高，牡蛎肉混合溶液中多肽分子已经被酶充分水解，因此加酶量对牡蛎多肽酶水解度不会再带来较大的影响。利用酶解法进行牡蛎多肽水解提取时，最佳加酶量为3%，此时牡蛎多肽酶水解度最大。

为了测定牡蛎多肽提取过程中酶解时间对多肽酶水解度的影响，设定牡蛎肉混合溶液料液比为1∶3，加酶量为3%，酶解反应温度为50 ℃，酶解反应溶液pH值为7.5，酶解时间分别设定为3，4，5，6，7 h，酶解完后测定牡蛎多肽酶水解度[8]。酶解时间对牡蛎多肽酶水解度的影响见表2。

表2 时间对牡蛎多肽酶水解度的影响Table 2 Effect of time on enzymatic hydrolysis degree of oyster polypeptides

由表2可知，在前5 h的水解过程中，牡蛎多肽酶水解度快速上升，当超过5 h后，牡蛎多肽酶水解度上升缓慢，主要原因是酶解反应进行一段时间后，牡蛎肉混合溶液中多肽分子不断减少，此时酶活力也开始下降，因此牡蛎多肽酶水解度趋于平缓状态。利用酶解法进行牡蛎多肽水解提取时，最佳酶解时间为5 h，此时牡蛎多肽酶水解度最大。

为了测定牡蛎多肽提取过程中溶液料液比对多肽酶水解度的影响，设定酶解时间为5 h，加酶量为3%，酶解反应温度为50 ℃，酶解反应溶液pH值为7.5，牡蛎肉混合溶液料液比为1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5，酶解完后测定牡蛎多肽酶水解度[9]。牡蛎肉混合溶液料液比对牡蛎多肽酶水解度的影响见表3。

表3 料液比对牡蛎多肽酶水解度的影响Table 3 Effect of solid-liquid ratio on the enzymatic hydrolysis degree of oyster polypeptides

由表3可知，当料液比大于1∶2时，随着料液比的降低，牡蛎多肽酶水解度快速升高，当料液比小于1∶2时，随着料液比的降低，牡蛎多肽酶水解度快速降低，主要原因是随着料液比的降低，酶解反应物浓度降低，酶解产物浓度降低，因此酶活力的抑制作用降低，促进酶解反应速度提升，随着料液比的进一步降低，反应物中的水分含量增加，酶与反应物的接触面积降低，同时酶活力开始降低。利用酶解法进行牡蛎多肽水解提取时，最佳料液比为1∶2，此时牡蛎多肽酶水解度最大。

为了测定牡蛎多肽提取过程中酶解反应温度对多肽酶水解度的影响，设定酶解时间为5 h，加酶量为3%，酶解反应溶液pH值为7.5，牡蛎肉混合溶液料液比为1∶3，酶解反应温度为40，45，50，55，60 ℃，酶解完后测定牡蛎多肽酶水解度[10]。酶解反应温度对牡蛎多肽酶水解度的影响见表4。

表4 温度对牡蛎多肽酶水解度的影响Table 4 Effect of temperature on enzymatic hydrolysis degree of oyster polypeptides

由表4可知，当酶解反应温度低于50 ℃时，随着温度的上升，牡蛎多肽酶水解度逐渐上升，主要原因是随着温度的上升，反应物的内能不断增加，酶与牡蛎多肽分子接触机会增加，酶解反应速度也不断上升。酶是一种具有活性的蛋白类物质，当温度超过一定的阈值时，酶的部分催化活性逐渐降低，酶活力也开始减弱，因此当温度高于50 ℃时，牡蛎多肽酶水解度开始降低。利用酶解法进行牡蛎多肽水解提取时，最佳酶解温度为50 ℃，此时牡蛎多肽酶水解度最大。

为了测定牡蛎多肽提取过程中溶液pH对多肽酶水解度的影响，设定酶解时间为5 h，加酶量为3%，酶解反应温度为50 ℃，牡蛎肉混合溶液料液比为1∶3，酶解反应溶液pH值为6.5，7，7.5，8，8.5，酶解完后测定牡蛎多肽酶水解度[11]。牡蛎肉混合溶液pH对牡蛎多肽酶水解度的影响见表5。

表5 pH对牡蛎多肽酶水解度的影响Table 5 Effect of pH on the enzymatic hydrolysis degree of oyster polypeptides

由表5可知，当酶解反应溶液pH值小于8时，牡蛎多肽酶水解度逐渐上升，主要原因是溶液pH值维持了酶活性的稳定性，促进酶与牡蛎多肽分子的结合，提高酶解反应速度。当酶解反应溶液pH值大于8时，牡蛎多肽酶水解度逐渐下降，主要原因是溶液pH值破坏了酶活性的稳定性，酶与牡蛎多肽分子的结合度降低，催化速度也开始降低。利用酶解法进行牡蛎多肽水解提取时，最佳pH值为8，此时牡蛎多肽酶水解度最大。

根据单因素实验结果，为保证牡蛎多肽提取过程效率，本文在进行提取工艺优化时，设定加酶量为3%，料液比为1∶2，以酶解反应时间(A)、酶解温度(B)以及pH(C)为自变量，以牡蛎多肽酶水解度为因变量，设计响应面实验[12]。牡蛎多肽酶水解度响应面实验设计方案与实验结果见表6。

表6 牡蛎多肽酶水解度响应面实验设计方案与结果Table 6 Design scheme and results of response surface experiment of enzymatic hydrolysis degree of oyster polypeptides

对牡蛎多肽酶水解度影响因素进行交互作用，得出牡蛎多肽酶水解度响应面图[13]。温度和时间与牡蛎多肽酶水解度的关系响应面图见图1，时间和pH与牡蛎多肽酶水解度的关系响应面图见图2，温度和pH与牡蛎多肽酶水解度的关系响应面图见图3。响应面的坡度陡峭程度表示影响因素对牡蛎多肽酶水解度交互时是否具有显著性，坡度平缓表示交互关系不显著，坡度陡峭表示交互关系显著[14]。

图1 温度和时间与牡蛎多肽酶水解度的关系响应面图Fig.1 Response surface diagrams of relationship between temperature, time and enzymatic hydrolysis degree of oyster polypeptides

由图1可知，随着酶解温度和酶解反应时间的增加，牡蛎多肽酶水解度先上升后下降，在酶解反应时间4 h和酶解温度45 ℃的条件下，牡蛎多肽酶水解度达到最大值49.5%，从响应面变化趋势可以看出酶解反应时间和酶解温度对牡蛎多肽酶水解度交互时均具有显著性影响。

图2 时间和pH与牡蛎多肽酶水解度的关系响应面图Fig.2 Response surface diagrams of relationship between time, pH and enzymatic hydrolysis degree of oyster polypeptides

由图2可知，酶解反应时间与pH对牡蛎多肽酶水解度交互时，酶解反应时间比pH对牡蛎多肽酶水解度的影响更加显著，牡蛎多肽酶水解度随着时间的变化呈现出先上升后下降的趋势。

图3 温度和pH与牡蛎多肽酶水解度的关系响应面图Fig.3 Response surface diagrams of relationship between temperature, pH and enzymatic hydrolysis degree of oyster polypeptides

由图3可知，酶解温度与pH对牡蛎多肽酶水解度交互时，二者对水解度均不具有显著性影响。

经过牡蛎多肽酶水解度影响因素交互实验，预测最佳提取工艺条件为酶解温度49.29 ℃、酶解反应时间4.38 h、pH 8、料液比1∶2、加酶量3%，预测牡蛎多肽酶水解度可达50.8%。对牡蛎多肽酶水解工艺条件进行3次实验验证，得出牡蛎多肽酶水解度为49.7%～50.2%，与预测值具有较高的吻合度。将获取到的牡蛎多肽水解液用1 000 Da过滤膜进行过滤，将滤液用360 Da过滤膜进行过滤，将两次得到的滤液进行烘干，称取多肽重量。牡蛎多肽3次验证实验结果见表7。

表7 牡蛎多肽3次验证实验结果Table 7 Results of three validation experiments of oyster polypeptides

由表7可知，使用200 g牡蛎肉水解后，按照优化后的工艺条件，提取到的牡蛎多肽平均值为1.28 g，平均提取率为0.64%。

牡蛎多肽抗氧化活性可通过牡蛎多肽对铁离子还原能力和羟基自由基清除率两个指标进行反馈[15]。牡蛎多肽对铁离子还原能力测定过程中，称取提取完成的牡蛎多肽0.5 g，加入250 mL蒸馏水定容，混合均匀后，将溶液稀释至浓度为0.5，1，1.5，2 mg/mL的牡蛎多肽溶液，分别加入浓度为0.1 mol/L的磷酸缓冲溶液1 mL，混合均匀后加入浓度为1%的FeSO4溶液，混合均匀后在50 ℃条件下进行水浴，保温20 min，冷却后，在700 nm波长处进行比色对照，测定牡蛎多肽对铁离子还原能力。牡蛎多肽对铁离子还原能力测定数据见表8。

表8 牡蛎多肽对铁离子还原能力测定数据Table 8 Determination data of reduction ability of oyster polypeptides to iron ion

由表8可知，随着牡蛎多肽溶液浓度的上升，对铁离子的还原能力逐渐增强，当溶液浓度为2 mg/mL时，牡蛎多肽溶液对铁离子的还原能力可达0.84，数据表明牡蛎多肽具有较强的铁离子还原能力。

牡蛎多肽对羟基自由基清除率测定时，取浓度为0.5，1，1.5，2 mg/mL的牡蛎多肽溶液各2 mL，加入2 mL蒸馏水，在波长510 nm处测定溶液吸光值，作为空白样品吸光值。测定牡蛎多肽对羟基自由基清除能力时，取浓度为0.5，1，1.5，2 mg/mL的牡蛎多肽溶液各2 mL，加入2 mL浓度为0.09 mol/L的水杨酸乙醇溶液，混合均匀后加入浓度为0.08 mol/L的双氧水，静置混合均匀后，在波长510 nm处测定溶液吸光值，作为待检测样品吸光值，最后计算牡蛎多肽对羟基自由基清除率。牡蛎多肽对羟基自由基清除率测定数据见表9。

表9 牡蛎多肽对羟基自由基清除率测定数据Table 9 Determination data of hydroxyl radical scavenging rate of oyster polypeptides

由表9可知，随着牡蛎多肽溶液浓度的上升，对羟基自由基的清除率逐渐上升，当溶液浓度为2 mg/mL时，牡蛎多肽溶液对羟基自由基的清除率可达59%，数据表明牡蛎多肽具有较强的羟基自由基清除能力。

本文以牡蛎多肽提取率为目标，对牡蛎多肽提取工艺影响因素进行优化，确定提取过程最佳提取工艺。通过实验测定的方式对牡蛎多肽的铁离子还原能力和羟基自由基清除率进行分析，表明牡蛎多肽具有较强的抗氧化活性。

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