**血站核酸实验室的建设和工作体会

　李浩 孙雪梅  吴宗泽  （**市中心血站） 

　关键词：核酸检测；实验室；管理；检测结果

　病毒核酸检测(NAT)能有效缩短检测窗口期，并检出献血者中存在的HBV隐匿性感染，能和酶免检测形成良好互补，有效降低输血相关传染疾病带来的风险。目前世界上许多国家和地区均已开展血液核酸检测。我国于2010年开始核酸检测的试点工作，2011年扩大试点范围。我站作为第二批核酸检测试点单位，于2011年底开始核酸实验室筹备工作，并于2012年3月通过省厅验收，开始试运行核酸检测。在此将试运行期间，核酸实验室的建设和运行情况以及经验和心得与大家共同分享。

　1  前期准备

　1．1 实验室建设 考虑到可能存在的交叉污染，我站核酸实验室独立设置在5楼（酶免实验室在4楼）。实验室参照《临床基因扩增检验实验室管理办法》的要求，将整个实验室划分为试剂储存和准备室、样品接收和处理室、样品制备室、核酸扩增检测室、报告室、办公室六个区域。各区配备专用的防护服、鞋子、清洁用具以及其他物品，并以不同颜色明确标识，以防混用。区域间安装有线对讲系统，六个区域共用一条走廊，但各区由缓冲间隔开，不可直接相通。人员通过缓冲间单向流动，标本通过传递窗单向流动，扩增区污染性垃圾从专用的医疗垃圾出口送出，不经过公共走廊，减少了污染机会。为了满足核酸检测实验室空气流向的要求，我们隔离了血站大楼原有的中央空调，在改造实验室时配套新建了给排风和空调系统，保证核酸扩增检测室处于负压状态，各区域风向流动符合规范。

　 1．2 仪器的选择 经过前期的认真考察，反复论证，综合考虑。最终以厂家投放仪器设备的方式引进了两套诺华Tigris核酸检测系统，两套系统互为备份。在试运行期间，曾出现过仪器因故障无法运行的情形，这时备份的核酸检测系统就良好的保障了工作的顺利进行。

　 1．3 人员培训 为核酸检测实验室配备专门的检验人员，并组织核酸检测的实验人员参加卫生部举办的核酸检测培训班，通过严格考试，取得卫生部临检中心颁发的培训合格证书。实验人员上岗前，还必须接受诺华培训人员关于实验原理、仪器操作、仪器维护等项目的理论和实践培训。每位实验人员都要独立经过模拟实验的实际操作，并且考核合格，取得授权后才能上岗。

　 1．4 质量体系文件建设 根据血站质量手册及程序文件，按照诺华厂家试剂和操作说明，并结合实际工作情况，建立起了较完善的实验室质量体系文件。包括岗位职责，工作流程，操作规程和相关记录等。内容全面，注重细节，确保实验操作规范，流程清晰合理，关键控制点准确有效。

　 在达到基本条件后，血站申请河南省卫生厅专家组对核酸检测实验室进行技术验收。专家组对核酸检测实验室的设置和设备，设施和环境，人员，设备管理和检测方法，标本管理，记录，报告，质量控制等方面逐项进行了认真检查和严格评审。认为本站实验室总体符合血站核酸检测试点实验室的要求，顺利通过验收并挂牌。

　2  工作实践

　通过验收后，我站便立即开展核酸检测的试运行工作。试运行期间，对市区三个采血点的全血标本进行核酸检测。具体工作情况如下。

　 2．1 标本采集和准备 使用具有旁路留样系统的血袋，用带分离胶的EDTA-K2抗凝的BD真空采血管留取核酸检测标本2管，各5ml。每4个小时由接血车在4℃条件下运送回站内离心（

　4℃，1500g x 15min），离心后置于4℃冰箱保存。一管48小时内使用诺华Tigris系统检测，另一管-30℃冰冻保存留样。暂未送样本到卫生部进行复查。

　 2．2 实验流程 实验前必须对仪器表面和工作台面进行消毒。然后打开仪器，启动仪器的预排空和日维护程序。为优化流程，在仪器自动进行维护的同时开始准备标本和进样架：将校准和质控品解冻后与标本一起平衡到室温，用一次性纸巾包裹着试管盖，先打**性校准和质控的盖子，将其摆放到进样架的相应位置上，再去除样本管的试管塞。这样能够最大程度的避免可能的气溶胶扩散造成的污染。上述操作必须由做好安全防护的实验人员在生物安全柜中进行。在操作仪器，处理标本，对照，耗材时不能使用同一双手套，必须按要求及时更换手套，并且注意手套不要接触试管口，不可在已开盖的试管上方移动等细节，以预防污染的发生。[1]

　日维护后，仪器进入待机状态。在试剂中加入内标，装载试剂和样本后即可创建工作列表，开始实验。加样开始后，密切关注仪器运行状态，按时添加耗材和后继样本，对提示和报警及时反应。加样完毕后，阳性校准和质控须加塞后弃于灌注84消毒液的废液瓶中，其他样管盖上试管塞后暂存于4℃冰箱。检测完成后，记录检测结果，打印实验报告。因错误和故障导致的无效结果待检重做，阳性标本则进一步进行HBV、HCV、HIV分项鉴别实验。阴性样本弃于医用垃圾袋中，用胶带封口后，及时从专用出口移至垃圾回收点，避免实验室遭受污染。

　 2．3 清洁维护 每天实验结束后，进样架必须按照要求用10% 84溶液浸泡15分钟后清洗干净。仪器表面，实验台面和传递窗使用不掉渣的一次性医用棉纱以10% 84溶液擦拭，15分钟后再用纯水彻底清洁，避免残留的84造成污染。金属部分还要再用酒精擦拭以避免腐蚀仪器。地面使用各区专用拖把以2% 84消毒液清洁。清洁的顺序是试剂储存室，样品处理室，样品制备室，核酸扩增检测室，按照从清洁区到污染区的原则进行。清洁完成后，打开所有紫外灯消毒60分钟，以最大程度上预防污染[2]。

　 严格按照仪器操作说明的要求进行日维护、周维护和月维护，各类硬件故障必须及时报修处理，每半年由厂家工程师进行仪器的校准和确认。使设备始终处于良好的工作准备状态。

　3  阶段小结

　3．1 检测结果 从3月试运行开始至7月初，我站核酸实验室共检测标本4981份，初检核酸阳性，酶免阴性的样本共10例。其中4例经鉴别为HBV阳性，另有1例，初检为阴性，再次进行复查和鉴别，证实是HBV阳性。酶免阴性，核酸阳性的报告率约为0.1%，高于混样检测的阳性检出率[4] ，与国内部分地区报道基本一致[3]。试运行期间我站还参加了卫生部临床检验中心开展的核酸检测室间质评一次，成绩合格。

　 这5例核酸阳性说明使用核酸检测对于血液安全的提升确实有显著意义。而1例假阴性则说明核酸检测虽然大大的提高了检测灵敏度，但仍然存在漏检的风险。所以我们在日常工作中更要做到认真细致，严格按照实验要求进行操作，提升实验的质量和水平，以防止阳性标本的漏检。

　 3．2 心得体会 通过试运行期间的工作，对于使用诺华Tigris系统进行血液筛查的优缺点有了一定体会。诺华Tigris系统是集标本加样、核酸提取、扩增、检测于一体的全自动检测系统，占用空间小，自动化程度高，操作简单，使用方便，并且关键控制点清晰明了，易于规范化，减少了人为差错事故发生的可能。设备的封闭性好，从加样，扩增，到产物灭活后垃圾干湿分离均在仪器内部自动进行，抗污染能力强。单人份的检测模式使得试剂灵敏度较高，其HIV，HCV，HBV的95%检测限分别为50 IU/ml，3 IU/ml，10

　 IU/ml。并且单人份检测可与酶免检测同步进行，缩短了血液放行的时间。

　 但诺华Tigris系统为大规模血液筛查设计，只能做定性测试，对于试点期间科研的摸索和数据收集比较不利。Tigris系统每次试验必须要做13个校准和质控，鉴别实验要做24个校准和质控，使得当样本量小的时候检测成本较高。另外由于自动化程度高，系统要求严格，当仪器故障或人员误操作引起某些错误时，往往会导致仪器终止运行。我站试运行初期总共发生4次导致整个实验终止的仪器故障，上百份试剂报废。经过工程师维修和调试后运行状况已比较稳定，已连续2月没有重大故障发生。

　 3．3 改进目标 在试运行阶段积累了经验，总结教训和进行思考后，将会在以后的工作中进行一些改进：一、参考**和**等血站的做法[3] ，初检核酸阳性的样本，再做2次复检。复检有1次以上阳性的样本才确定为阳性，血液直接报废。阳性样本于-20℃冻存，一段时间后统一进行鉴别，这样可以提高鉴别率，节省大量试剂。二、逐步扩展试运行的检测范围，将单采血小板纳入核酸检测试运行，探讨研究保存期较短的血小板的核酸检测工作模式。三、增加核酸阳性献血者的追踪工作，并采样进行进一步研究，以确定该献血者是窗口期感染还是隐匿性乙肝。

　4   结语 对我站而言，核酸检测是一项全新的工作，我们要充分发挥积极性和创造性，以方便工作为原则，以防止污染为关键，以保证质量为根本，深入探索并认真做好实验室建设和工作的细节问题，以达到确保核酸检测质量，提升血液安全水平的目的。

　参考文献

　[1]李文,王欢,王乃红.血站核酸检测实验室建设和管理的细节问题.中国输血杂志,2011, 24(7): 553-554

　[2]邹峥嵘,谢云峥,林俊杰.采供血机构开展病毒核酸检测关键控制点初探, 中国输血杂志,2011, 24(3): 177-178

　[3]邓雪莲,安万新,梁晓华.**市血液中心血清学检测与核酸检测并行的效果观察.中国输血杂志,2012 ,25(1): 38-40

　[4]曾劲峰,许晓均,李活.核酸血筛在献血者常规筛查中的应用研究.中国输血杂志,2011, 24(7):556-559